Einleitung

Pseudomonas aeruginosa ist ein fakultativ humanpathogenes gramnegatives Bakterium, das durch steigende Resistenzraten gegen gängige Antibiotika insbesondere bei nosokomialen Infektionen und Mukoviszidose eine immer größere Rolle bei hospitalisierten Patienten spielt [1] [2]. Man unterscheidet chronische und akute Infektionen, wobei die chronische Besiedelung mit P. aeruginosa insbesondere bei Immunsupprimierten und Mukoviszidose-Patienten auftritt. Eine solche Infektion ist mit stärkerer Krankheitsprogression und pathogenetisch mit einer Anpassung an den Wirt in Form von veränderter Motilität, Adhäsion und Biofilmbildung assoziiert [2].

Eine weitere Möglichkeit der Adaption an die Wachstumsbedingungen im Wirt stellt die Aufnahme von Nährstoffen, insbesondere Spurenelementen, dar. So nutzt die menschliche Immunabwehr spezialisierte Proteine, die kalziumabhängig Schwermetallionen wie Zink(II) oder Eisen(III) binden und so dem Zugriff der Bakterien verwehren können ([Abb. 1]) [3]. Dieses Konzept wird als nutrient immunity bezeichnet [4]. Da diese Kationen für das Bakterienwachstum und die Expression bestimmter Virulenzfaktoren eine wichtige Rolle spielen, haben sich bei vielen Bakterien evolutionär als Antwort ausgeklügelte Schwermetallaufnahmesysteme entwickelt.

Dies soll am Beispiel der Zinkaufnahme von P. aeruginosa erläutert werden: P. aeruginosa besitzt zwei unterschiedliche Aufnahmesysteme für Zink-Kationen – einen stereotypen ABC (ATPase binding cassette)-Transporter (ZnuABC) und ein Zinkophor-Aufnahmesystem (Pseudopalin und assoziierte Proteine) [5]. Das Prinzip des letzteren ist dem der Siderophore sehr ähnlich; so exportieren die Bakterien den niedermolekularen Metallophor Pseudopalin zunächst über die Membran in den Extrazellularraum. Dort bindet es hochaffin an Zink(II)-Ionen ([Abb. 2]). In diesem beladenen Zustand kann der Pseudopalin-Metall-Komplex nun zurück ins Zytosol transportiert werden, wo er entladen und der Metallophor wieder exportiert werden kann. Pseudopalin bindet Zink mit einer Komplexbildungskonstante von annähernd KD=15, weist aber für andere zweiwertige Kationen wie Kupfer(II) oder Nickel(II) ähnliche Werte auf [6]. Daher wird es als Metallophor und nicht als Zinkophor bezeichnet. Durch die extrem hohe Affinität solcher und anderer Metallophore zu ihrem Liganden sind die Bakterien in der Lage, auch in den nährstoffarmen Bedingungen des Host-Pathogen-Interface ihr Überleben zu sichern [7]. Evolutionär scheint auch hier schon der nächste Schritt getan worden zu sein, da es Berichte über Siderophor-bindende Proteine gibt, die den Wirt befähigen, diesem Prozess Einhalt zu gebieten [8].

Weiterhin werden nicht allein die beiden Zinkaufnahmesysteme aktiviert, wenn das Bakterium einem Zinkmangel ausgesetzt ist, sondern ihr Regulator Zur (zinc uptake regulator protein) führt auch zu einer erhöhten Ausbildung bestimmter Virulenzfaktoren wie Biofilmbildung, Motilität, einer Aktivierung des Las-Quorum-Sensing-Systems und der Regulation bestimmter Antibiotikaresistenzgene [7] [9]. Durch die Aktivierung des Quorum-Sensing, einem „Kommunikationssystem“ der Bakterien, werden zusätzlich weitere Virulenzfaktoren wie beispielsweise die extrazellulären Elastasen LasA und LasB reguliert, die durch Gewebezerstörung zur Persistenz des Erregers im Wirt beitragen [10].

Virulenzfaktoren: Beispiel Biofilmbildung

Generell lassen sich die Virulenzfaktoren von P. aeruginosa phänomenologisch in Adhäsion, Zytotoxizität, Biofilmbildung und Motilität, Quorum-Sensing und Überlebensstrategien in besonderen Umgebungen unterteilen. Als Beispiel für die Komplexität der Regulation und Ausbildung der Virulenzfaktoren von P. aeruginosa soll hier kurz auf die Biofilmbildung eingegangen werden.

Biofilme sind für viele Bakterien ein wichtiger Teil ihrer Überlebensstrategie in verschiedenen Umgebungen. Es handelt sich dabei um eine Organisationsform von Mikroorganismen, die sich meist durch schleimumgebene Aggregation der Bakterien auszeichnet und zur Antibiotikaresistenz und Kolonisierungsfähigkeit der Erreger beiträgt. Wichtigster Regulator ist in der Regel das Quorum-Sensing, da die Bildung eines Biofilms ein extrem komplexes Geschehen ist und für die Bakterien nur lohnenswert, wenn eine gewisse Populationsdichte vorhanden ist. Bei P. aeruginosa spielt insbesondere das Rhl-Quorum-Sensing-System eine Rolle bei der Biofilmbildung, da es die Produktion von Rhamnolipiden und Pyocyanin steuert. Rhamnolipide sind ein Schlüsselfaktor in der Bildung und Reifung von Biofilmen bei P. aeruginosa und nehmen unter anderem eine Surfactant-artige Funktion in diesen ein. Dies führt zur Aufrechterhaltung von Wasser- und Sauerstoffkanälen und damit zur Versorgung der Bakterienpopulation in der Biofilmmatrix. Pyocyanin hingegen ist ein Zellgift, das artfremde und arteigene Bakterien lysiert und so zur Freisetzung von DNA in die Biofilmmatrix führt. In Kombination mit kationischen Polysacchariden bildet die DNA das Grundgerüst der Biofilme von P. aeruginosa [11]. Unabhängig von der Steuerung durch Quorum-Sensing scheint auch die Zinkaufnahme eine Rolle bei der Biofilmbildung zu spielen; so zeigen Deletionsmutanten von Bestandteilen der beiden Zinkaufnahmesysteme in Minimalmedium eine signifikant verminderte Biofilmbildung [9].

Faszinierenderweise führt ein Überschuss an Zink- oder Kupfer-Ionen ebenfalls über den Regulator Zur zu einer Aktivierung von Entgiftungsmechanismen. Dieser Effekt lässt sich pathomechanistisch anhand der Vergiftung von den Bakterien durch einen Überschuss an Zink- und Kupfer-Ionen nach der Phagozytose durch Makrophagen erklären. Auch dieser Schutzmechanismus ist ein gutes Beispiel für die extreme Versatilität von P. aeruginosa gegenüber Umweltfaktoren [7].

Proliferationshemmung als indirekter Messparameter für die Inhibition der Schwermetallaufnahme

Mastropasqua et al. konnten zeigen, dass das Wachstum von Deletionsmutanten beider Zinkaufnahmesysteme in künstlichem Sputum-Medium stark vermindert ist. Dieses Medium soll die Schwermetallarmut und die Präsenz von Chelatoren im Sputum simulieren [5].

Weil die Aufnahmeeffizienz von Zink(II)- und Eisen(III)-Kationen direkt mit der Proliferation korreliert, lässt sich der Einfluss von Hemmern der Zink- oder Eisenaufnahme prinzipiell durch antiproliferative Effekte in Minimalmedien messen. Dieser Ansatz ist neben P. aeruginosa (Zink) in dieser Studie schon an einzelnen Bakterien (Escherichia coli [Eisen], Salmonella enterica [Zink]) und in etwas anderer Form an Hefen (Saccharomyces cerevisiae [Zink]) in Screenings verfolgt worden [12] [13] [14].

Die grundsätzliche Vorgehensweise dieser Screenings ist im Prinzip immer gleich: Die Mikroorganismen werden in einem schwermetallarmen Flüssigmedium, z. B. Vogel-Bonner-Minimalmedium oder 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) Puffer ohne Eisen, unter Einfluss der Testsubstanzen kultiviert und auf ihr Wachstum hin untersucht. Bei Bakterien lässt sich die Turbidität der Lösung als einfach zu bestimmenden Wachstumsparameter verwenden. Im Falle des erwähnten Screenings an S. cerevisiae wurde der Zinkmangel alternativ mittels Mutanten, die Grün-fluoreszierendes Protein (GFP) bei geringen intrazellulären Zink-Konzentrationen exprimieren, auf einem anderen Weg messbar gemacht. Im Weiteren muss dann verifiziert werden, ob die unter diesen Bedingungen wirksamen Substanzen rein bakterizid wirken oder tatsächlich einen Einfluss auf die Metallaufnahme haben. Eine einfache Möglichkeit hierfür besteht darin, dem Medium die fehlenden Mikronährstoffe zuzusetzen oder das Experiment in Vollmedium zu wiederholen.

Substanzen, die das Wachstum unter den Minimalbedingungen hemmen, dies aber nicht unter normalen Wachstumsbedingungen in einem Vollmedium tun, sind nun interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen.

Auswahl der Substanzbibliothek

Ein wichtiger Punkt bei der Durchführung derartiger Screenings ist die Auswahl der Substanzbibliothek. Auch hier existieren verschiedene Ansätze: Ilari et al. beispielsweise haben aus einer hauseigenen Substanzbibliothek 36 zinkbindende Reinsubstanzen ausgewählt, wohingegen Mike et al. aus 32 000 Extrakten jene auswählten, die gerade keine Eisen-chelatierenden Eigenschaften aufwiesen. In dem in unserer Gruppe durchgeführten Screening sind 190 Naturstoffe und aufgereinigte Fraktionen aus Pflanzenextrakten getestet worden, wobei Makromoleküle jeglicher Art (Polysaccharide, Gerbstoffe oder Ähnliches) ausgeschlossen wurden ([Abb. 3]). Ziel bei der Erstellung von Reinsubstanzbibliotheken sollte stets eine große chemische Diversität, d. h. das Vorhandensein vieler verschiedener molekularer Grundgerüste, sein. Weiterhin kann es von Vorteil sein, bestimmte Substanzen auszuschließen, wenn sie Merkmale sogenannter PAINS (Pan assay interfering natural substances) aufweisen [15]. Hierbei handelt es sich um besonders reaktive Strukturelemente wie zum Beispiel Catechole, Chinone (jeweils redoxaktiv) oder Mannich-Basen (Reaktion mit Bionukleophilen), die auf eine unspezifische Weise mit dem verwendeten Assay-System interferieren [15].

Validierungsstrategien für Schwermetallscreenings

Um die in dem initialen Screening-Assay generierten Ergebnisse zu validieren, existieren verschiedene Vorgehensweisen: Am naheliegendsten ist die Bestimmung der antibakteriellen Aktivität an Deletionsmutanten der anzusprechenden Schwermetallaufnahmesysteme. Im Vergleich zu unbehandelten Mutanten sollte hier keine zusätzliche Wachstumshemmung durch die Substanz erkennbar sein. Durch diese Methode kann zwar sehr leicht überprüft werden, ob die untersuchte Substanz ihre Wirkung über das designierte Wirkprinzip ausübt, allerdings werden gleichermaßen auch alle anderen möglichen Mechanismen beiseitegelassen. Diese Herangehensweise wurde mit Erfolg von Ilari et al. angewandt, die tatsächlich zwei Substanzen identifizieren konnten, welche durch eine Blockade des löslichen Teils des ZnuABC-Transporters von S. enterica ser. Typhimurium die Zinkaufnahme hemmen. Anhand der Cokristallisation mit dem Protein und der Hemmung der Invasion in Caco-2-Zellen konnte dieser Wirkmechanismus bestätigt und sogar mit einer verminderten Virulenz assoziiert werden [12]. An dieser Studie ist die sehr hohe Trefferrate von 2 Hits aus nur 36 getesteten Substanzen hervorzuheben.

Ein alternativer Ansatz besteht darin, die im Minimalmedium fehlenden Spurenelemente zu supplementieren und den Effekt der Testsubstanzen auf das Wachstum nochmals zu evaluieren. Dies kann in Form der Zugabe definierter Konzentrationen der abwesenden Metallionen oder durch Testung in einem Vollmedium geschehen. In einem in unserer Gruppe durchgeführten Screening wurde letzterer Ansatz gewählt, um die potenziellen Zielstrukturen der Testsubstanzen möglichst offen zu halten, wobei sich die Zahl der initialen Hits von 27 auf 4 deutlich reduzierte.

Um nun den Effekt der ermittelten Substanzen weiter zu charakterisieren, sollte der Effekt einzelner Schwermetalle auf die Wirkung der Substanzen untersucht werden. In unserem Screening konnten wir durch Zugabe von Zink-Ionen keine signifikante Änderung der Proliferationshemmung bei den Hits beobachten. Auch die Testung in verschiedenen Zink-assoziierten Virulenz-Assays ([Tab. 1]) brachte keine Hemmstoffe hervor, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Hits in diesem Screening falsch positiver Natur waren. Eine Zusammenfassung der unterschiedlichen Screening-Schritte ist in [Abb. 4] gezeigt.

Ilari et al. charakterisierten ihre Hits ebenfalls durch Zinkzugabe und konnten zeigen, dass die Wirkung der ermittelten Substanzen durch Zinksättigung verstärkt werden konnte. Die Autoren stellten die Hypothese auf, dass dies durch eine höhere konformationelle Stabilität des Zink-ZnuA-Komplexes bedingt ist.

Auch Mike et al. haben in ihrem Screening an E. coli Substanzen identifiziert, die das Wachstum der Bakterien unter eisenarmen Bedingungen hemmen. Hier wurde zur Verifizierung der Ergebnisse erneut unter Eisenzusatz getestet und tatsächlich ließ sich die Wirkung der Substanzen so aufheben. Die Autoren führten dies auf die Fähigkeit der Substanzen zurück, Chelatkomplexe mit Eisen zu bilden [14].

Eine besondere Rolle in den vorgestellten Screenings nimmt auch an dieser Stelle das durch Simm et al. durchgeführte Screening an S. cerevisiae ein. Dieses wurde in einem apathogenen Modellorganismus durchgeführt und später im Pathogen (Candida albicans) verifiziert, wobei die Autoren sehr kleinschrittig vorgegangen sind und den genauen Einfluss der Treffersubstanzen auf die Feinregulation des intrazellulären Zinkspiegels untersucht haben. Für die Details sei auf die ursprüngliche Publikation verwiesen. Hervorzuheben ist aber die methodologisch sehr saubere Validierung des primären Screening-Readouts (GFP-Fluoreszenz bei niedrigen intrazellulären Zinkspiegeln) durch erneute Bestimmung der Zinklevel mit einem hiervon unabhängigen Fluoreszenzindikator [13]. Außerdem sind durch die sehr spezifische primäre Screeningmethode nur wenige falsch positive Hits zu erwarten, was ein bedeutender Vorteil gegenüber Proliferationsscreenings ist. Allerdings ist dazu die genetische Veränderung der Mikroorganismen nötig.

Die Parameter und Ergebnisse der erwähnten Screenings sind in [Tab. 1]